1樓：百優生物
elisa關鍵是訂乙個可靠的試劑盒。
如果盒子已經訂了，剩下的就是自己操作了。
乙個，盡量用八道或者十二道移液器加樣。對於相同的試劑，經如二抗，酶，顯色液，終止液等。
另乙個，自己的樣品，因為每一孔的樣品不一樣，用排槍加有些麻煩，如果一次的樣品比較少，而自己加樣又比較快，可以乙個孔乙個孔的加，但如果想一次把96或者48t的做完，可以先擺好一些pcr管或者準備乙個96孔細胞培養板。將自己的樣品先加到pcr管或者培養板中（此板間距與酶板板相同）。記得加一定的餘量，如一次加樣是50ul，可以先加70ul。
加完後再用排槍加樣，這樣可以縮短加樣時間，減小每個孔間的時間誤差。
另乙個，如果有多餘的孔，標準品孔可以做復孔，在自己的樣品前加一次標準品，加完樣品後再加一次標準品。
如果孔不夠，那麼可以將標準品放在樣品中間加（比如先加四十個孔，加完標準品再加五十孔）
2樓：威威少少少
如果盒子沒有什麼問題，我個人覺得前處理和甩板比較關鍵，特別是呋喃、孔雀石綠這些專案的前處理，麻煩得要死
雙抗夾心elisa的步驟是什麼？
3樓：藍般若戀
elisa操作步驟（雙抗體夾心法）
1. 包被過程(注意設定空白對照,陰性對照):
將所用抗原用包被稀釋液稀釋到適當濃度，每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;棄去孔中液體，(為避免蒸發,板上應加蓋或將板平放在底部有溼紗布的金屬溼盒中)。
2.pbs洗3次，每次3分鐘。
具體為：吸乾或甩乾孔內反應液；用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注板孔後，即甩去）；浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；吸乾孔內液體，可甩去液體後在清潔毛巾或吸水紙上拍幹；重複操作滌3次。
3. 加入待檢測樣品(建立合適的濃度梯度):
檢測時一般採用1:50-1:400的稀釋度, 應採用較大稀釋體積進行,一般保證樣品吸取量》20μl。
將稀釋好的樣品加入酶標反應孔中，每樣品至少加雙孔，每孔100μl，置於37℃,40-60min。
4 .pbs洗3次，每次3分鐘。
5. 加入酶標抗體:
酶標抗體:根據酶結合物提供商提供的參考稀釋度進行或建立濃度梯度，37℃30-60min之間，短於30min往往結果不穩定，每孔加100μl。
6 .pbs洗3次，每次3分鐘。
7. 加入底物液(現用現配):
tmb(四甲基聯苯胺)使用液:tmb(10mg／5ml無水乙醇) 0.5ml底物緩衝液(ph5.
5)10ml0.75％h2o232μl，底物加入量每孔100μl（tmb空白顯色孔除外）,置37℃避光放置20-25分鐘。
8. 終止反應:
每孔加入終止液50μl(2m h2so4)終止反應, 此時藍色立轉黃色，於20min內測實驗結果。
9.結果判斷:
可於白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺。也可測吸光值：
在elisa檢測儀上，tmb反應產物檢測需要450nm波長，檢測時一定要首先進行空白孔系統調零。用測定標本孔的吸收值與一組陰性標本測定孔平均值的比值(p/n)表示，當p/n大於2時作為抗體的效價即大於陰性對照吸光值的2倍，(數值的大小依具體檢測要求而定)。
4樓：匿名使用者
（1）單抗包被-抗原-酶標二抗-底物顯色。
本法首先也是用特異性抗體包被於固相載體，經洗滌後加入含有抗原之待測樣品，如待檢樣品中有相應抗原存在，即可與包被於固相載體上的特異性抗體結合，經保溫孵育洗滌後，即可加入酶標記特異性抗體，再經孵育洗滌後，加底物顯色進行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。
（2）單抗包被-抗原-二抗-酶標二抗-底物顯色。(改良雙抗體夾心法)本法首先是將特異性抗體a包被於固相載體，經洗滌加入含有欲測抗原之待檢樣品。經孵育洗滌後再加一次未標記的特異性抗體b，而這次加入的抗體b於第一次包被於固相載體上的特異性抗體a對被測抗原來說都是特異性的，但不是用同種動物免疫製備的，否則可出現非特異性反應。
經孵育洗滌後，再加酶標記抗b抗體，再經孵育洗滌後加底物顯色進行測定。這種方法與雙抗體夾心法不同之處是多加了一層抗體。因此，放大的倍數更高，故比雙抗體夾心法更加靈敏。
同時避免標記特異性抗體，而另一優點是只要標記一種抗抗體，即可達到多種應用。
5樓：匿名使用者
你說的是雙抗體夾心法吧！它是用來測抗原的！例如測B肝病毒的表面抗原，如果陽性可以說明得B肝了！步驟： 1.平衡20min（把需要的東西準備好，保證實驗
6樓：匿名使用者
雙抗體夾心的意思是包被抗體-檢測抗原-酶標抗體形成夾心結構。
至於是單抗或者多抗都可以。
如果是酶標二抗（二抗就是抗抗體）的話，一般是包被抗原-抗體-酶標二抗，這種是間接法的
elisa的原理和實驗步驟
7樓：鬱悶神馬
1. elisa的原理
elisa的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。
用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體複合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。
加入酶反應的底物後，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由於酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。
操作步驟:
1．從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和乾燥劑請放回鋁箔袋內壓 實自封條，密封口袋，放回4℃。
2．空白孔加標準品和標本稀釋液，其餘相應孔中加標本或不同濃度標準品(100ul/孔)，用封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育90分鐘。
3．提前20分鐘準備生物素化抗體工作液。
4．洗板5次。
5．空白孔加生物素化抗體稀釋液，其餘孔加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育60分鐘。
6．提前20分鐘準備酶結合物工作液。避光室溫(22-25 ) ℃ 放置。
7．洗板5次。
8．空白孔加酶結合物稀釋液，其餘孔加入酶結合物工作液(100ul/孔)。用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱，避光孵育30分鐘。
9．開啟酶標儀電源，預熱儀器，設定好檢測程式。
10．洗板5次。
11．加入顯色底物(tmb)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分鐘。
12．加入終止液100ul/孔, 混勻後即刻測量od450值(3分鐘內)。在儀器儲存讀數結果並列印乙份紙質結果。
13．實驗完畢後將未用完的試劑按規定的儲存溫度放回電冰箱儲存至有效期結束。
建議儲存酶標板框，以備下次或者今後試驗使用。
8樓：匿名使用者
elisa原理就是固定化抗原或抗體與抗體或抗原之間的免疫相互作用。基本步驟就是：包埋、封閉、競爭、洗滌、結合、洗滌、底物反應、測量分析。
9樓：匿名使用者
檢測原理: 本實驗採用雙抗體夾心elisa法。抗人il-4單抗包被於酶標板上，操作步驟: 1．從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和
elisa實驗檢測抗體的實驗步驟？ 20
10樓：匿名使用者
操作步驟：
（1）將特異性抗原
與固相載體聯結，形成固相抗原。洗滌內除去未結合的抗容原及雜質。
（2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體複合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。
（3）加酶標抗抗體,主要根據你的一抗來確定二抗用什麼。可用酶標抗人ig以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人igg檢測igg抗體。固相免疫複合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。
洗滌後，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。
（4）加底物顯色
間接法由於採用的酶標二抗是針對一類免疫球蛋白分子(如抗人igg),因此該法只需要換固相抗原，即可用一種酶標二抗檢測各種與抗原相應的抗體，具有更廣泛的通用性。
本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
如果有其他問題，可以聯絡我，呵呵！
11樓：匿名使用者
1、包被抗原（製備包被板）
2、加入待測抗體，37℃反應1小時，洗板。
3、加入酶標二抗，37℃反應1小時，洗板。
4、加入底物，室溫避光15min後用硫酸終止讀數。
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